Gen_Injeneria

The transcription discusses the technologies of recombinant DNA, molecular cloning, and genetic engineering. It explains that cloning involves transferring genetic material from one organism to another, and the process includes obtaining DNA fragments, combining them in new combinations, and transferring the new DNA construct into a living cell. Restriction enzymes, such as type 2 restriction enzymes, play a crucial role in DNA cloning by cutting DNA at specific recognition sites. The use of vectors, such as plasmids, is also important in cloning. Plasmids are circular DNA molecules that can replicate autonomously and are used as vectors for cloning DNA fragments. The transcription also mentions the transformation process, which involves transferring free DNA into bacterial or eukaryotic cells. It further discusses the use of bacterial and plant vectors in cloning and the different methods of genetic transformation, including chemical, electrical, and biological methods. The transcript Технології рекомендантних ДНК Молекулярне клонування Генна інженерія Сукупність експериментальних процедур, що дає можливість здійснити перенесення генетичного матеріалу ДНК з одного організму в інший. Клонування ДНК Клон – це популяція клетин, ідентичні одній в початковій клетині. Клонування генів – це система методів, що використовується для отримання клонованих ДНК, виділення бажаного гену з якого-небудь організму, вбудовування його в плазміду, тобто в вектор, введення в клетину організму господаря. Багаторазова реплікація. Етапи клонування ДНК Перше – це отримання фрагменти ДНК, далі – поєднання їх у нові комбінації, перенесення, тобто трансформувати цю нову ДНК-конструкцію у живу клетину, ну і проанализувати результати. Для клонування ДНК потрібен вектор, ну і, звісно, фрагмент ДНК. Бактеріофаги – це віруси, що інфікують бактерії. Рестриктаза типу 2. Рестриктаза типу 2 – це ендонуклеази бактеріального походження, які розщеплюють двуничасту ДНК лише под специфічним сайтом рестрикції або сайтом впізнавання. Як правило, сайт рестрикції складається з 4-8 пар нуклеотидів. Сайт рестрикції впізнається незалежно від того, з якого організму виділена ДНК. Ендонуклеази типу 1 та 3 – це складні білки, що мають активність, рестриктуючи її, ендонуклеази та метилази. Рестриктази типу 1 розрізають на різні відстані від сайту впізнавання – від 400 пар нуклеотидів до 7000 пар нуклеотидів. Розрізання супроводжуються гідролізом АТФ. Рестриктази типу 3 розрізають ДНК на відстані 25 пар нуклеотидів від сайту впізнавання. Ці рестриктази не використовуються у сферні рекомендаційних молекул. Рестриктази є подарунком природи. Вони не виконують ніяких функцій стосовно ДНК тих організмів, в яких їх було знайдено. В дійсності вони становлять захисний механізм в першу чергу у бактерій, завданням якого є розрізання та знищення ДНК бактеріофагів до того, як вони встигнуть інтегрувати у геном клітини-хазяйна та розпочати свою чорну справу. Бактеріальна ДНК є сійкою до власних рестриктаз, тому що власні сайти рестрикції, як правило, є високометилюваними. Це маскує їх від розчеплення рестриктазами. МЕТИЛЮВАННЯ Механізм метилювання ДНК. 5 метилозетин утворюється в результаті роботи ДНК метилтрансфераз, який каталізує перенесення метильної групи S-ДНК-лігаза, молекулярний клай. ДНК-лігаза – це фермент, здатний утворювати фосфатні зв'язки між нуклеотидами у молекулі ДНК за рахунок енергії АТФ. ДНК-лігаза не відчуває різниці між ДНК з різних джерел. Вона не має змогу отримувати хімерні ДНК, ДНК-молекули. Основні ферменти, що використовуються в клонуванні – рестриктази типу 2 та ДНК-лігаза. Фрагменти ДНК, вирізані за допомогою рестриктазу, клонуються у вектори, що відповідають певним вимогам. Вектори, що використовуються для клонування. Вектор – це молекула ДНК, в яку може бути вклонований фрагмент ДНК, і яка здатна до реплікації у критині свого сподаря. Перший – це плазміди. Це вектор на основі бактеріофагу L. Третій – косміди. Четвертий – вектори на основі бактеріофагу P1. Вектори, що використовуються для клонування. Вектор – це молекула ДНК, в яку може бути вклонований фрагмент ДНК, і яка здатна до реплікації у критині господаря. Невеликий розмір, щоб його ДНК можна було включити бажанген. Здатність до реплікації, щоб стабільно підтриматися у критині господаря. Здатність до ампліфікації. Здатність багаторазового подвоєння та утворення великого числа копій, а отже великої кількості відповідного йому білку. Наявність унікального сайту рестирикції. Гарантія експресії чужорідного ДНК. Наявність маркерного гену, наприклад, антибіотику, що підвищує ефективність селекцій критин, щоб отримати чужородний ген. Бактеріальні плазміди. Це позахромосомні генетичні елементи, здатні до автономної реплікації, які, як правило, являють собою кільцеву дованичістю молекул ДНК розміром від 1 до кількох сотень тисяч парануклеотидів. Кількість копій на критину – від 1 до декількох сотень. Плазміди можуть нести гени стійкості до антибіотиків. Плазміди використовують для колонування фрагментів довжиною від 5 до 10 тисяч парануклеотидів. Бактеріальні вектори. Це штучне перебудовання бактеріальні плазміди, які місять фрагмент початку реплікацію, полілінкер і ген-маркер. Вектор може бути розрізаний однією з рестриктаз у полілінкері та за допомогою олігази шити із будь-яким фрагментом ДНК. Трансформація. Трансформація – це перенесення вільної ДНК в бактеріальну або еукаріотичну критину. Властивість критин приймати чужу ДНК називається компетенцією. Ефективність трансформації залежить від ступеня компетенцій критин, від структури ДНК, від розміру плазмід. Типи трансформації. Хімічна і електрична, тобто електрополяція. Біологічні системи молекулярної біотехнології. Основні робочі коники молекулярної біотехнології – це Escherichia coli, тобто грамнева непотогенна паличка Secheromus servicei – непотогенній однокритинній організм і еукаріотичний аналог Escherichia coli, ну і культура еукаріотичних критин. Синя-біла сфлексія колоній. Тільки бактерії з плазмідею мають ген стійкості до ампліциліну. Якщо плазміда мізить ставку, то колонії залишаються білими. Якщо плазміда не мізить ставку, то колонії стають синіми. Генетично модифіковані рослини. Це рослини, геном яких змінено шляхом перенесення гену інтересу. Методи генетичної трансформації рослин. Трансформація за допомогою агробактерій і пряма трансформація. Взаємодії агробактерій з рослиною. Існують вірулентні та авірулентні штани агробактерій. Вірулентні залежать від присутності плазмід у бактеріальній клітині. Корончасті гали. Спостереження. Мають підвищений рівень фітогармонів, ауксинів та цитокінинів, які викликають утворення пухлини. Синтезують специфічні речовини опіни, які є похідними амінокислот, сукрів та кетокислот. Опінюють джерелами азоту та вуглецю для агробактерій. Головна пухлина вмістить фрагмент ДНК плазміди агробактерій. Ті плазміди агробактерії широко засліджувалися у 70-х роках у лабораторіях доктора Челла та М. Ван Тагю. Складаються чотирьох ділянок. Дві пов'язані з пухлиноутвореннями, це ТДНК та ВІР-область. Дві інші приймають участь у кон'югаційному переносі та реплікації плазміди у клітинах бактерій. ТДНК переноситься у росинну клітину. Вона місить гени синтезу, фітогармонію та опінію та фланкована специфічними граничними послідовностями, які є необхідними для трансформації. Ті плазміди агробактерії ВІР-область Гени, що відповідають за перенесення ТДНК ВІР-А та ВІР-ДЖЮ конструктивно експресуються на низькому рівні. Контролюють активацію інших ВІР-генів. ВІР-А Ген кінази ВІР-А трансфорелює ВІР-ДЖЮ, який є активатором транскрипції інших ВІР-генів. Перенесення ТДНК ініціюється ендонуклазою, що кодується ВІР-Д1, ВІР-Д2. Система бінарних векторів Система бінарного вектору складається з двох плазмід, що автономно реплікується у клітині агробактерій Tumifensins. Трансформаційний вектор, у яких між границями ТДНК замість онкогенів кодованого генінтересу. Типовий трансформаційний вектор складається з лівої та правої границі ТДНК, з полілінкеру, промотор для експресії генів у рослинній клітині, ген для селекції у рослинній клітині з власним промотором, також маркерний ген для селекції у бактеріальній клітині і точка початку реплікацій. Перенесення генів на інші плазміди Трансформаційний вектор складається з лівої та правої границі ТДНК, з полілінкеру, Перенесення гену інтересу у рослину Трансформація з використанням агробактерій Трансформація листкових дисків Трансформація гематофітів Методи прямого переносу генів Біолістіка, тобто генний пістолет Методи прямого перенесення генів Мікроін'єкція, тобто шприцом-голкою Вводять агробактерії в клітину Генетично маніпульовані рослини у сільському господарстві Наприклад, золотий рис Гени перенесені від ґрунтової бактерії та жовтого нарцису або кукурудзи У ньому підвищені вміст беккертин